白菜薹(Brassica campestris ssp. chinenesis L.)是十字花科芸薹属芸薹种白菜亚种中一类容易抽薹的品种类型，是中国的特产蔬菜，在长江中下游地区广泛栽培，湖南省的种植面积已超过1.3×10⁴ hm² (周晓波, 2010)。白菜薹以幼嫩的花薹和叶片为食用部分，薹粗嫩肥白，纤维素含量低，营养丰富，味道鲜美，且具有清热、杀菌、降血脂的功效(王正银, 1999, 中国农业科技出版社, pp.198-212)。

白菜薹是异花传粉作物，具有明显的杂种优势。目前由于没能找到合适的杂交制种方法，生产上应用的品种大多是常规品种。自交不亲和系制种存在着亲本繁殖困难、杂交率不稳等问题(张慧等, 2010)，没有得到有效利用。冯辉等(1995)在大白菜中发现的核复等位基因雄性不育性，其特点是不育性状稳定且无不良性状伴生，近年来受到了白菜育种工作者的普遍重视，利用该材料已经创制出多个白菜类蔬菜作物的雄性不育系(Li et al., 2009; 周鹏等, 2010; 张俊等, 2010; 冯辉和娄广学, 2011)。该类核不育材料的不育性由同一位点的3个复等位基因控制，Ms基因为显性不育基因，ms基因为Ms基因的等位隐性可育基因，Msf基因为Ms基因的等位显性恢复基因，三者之间的显隐性关系为Msf>Ms>ms (Feng et al., 1998)。遗传模型如图1所示。

图1 大白菜核基因雄性不育复等位基因遗传模型 Figure 1 Multiple allele model for genetic male sterility in Chinese cabbage

在不育系转育过程中，由于该类不育材料特殊的遗传机制，基因型不同的植株(Ms^fMs^f; Ms^fMs; Ms^fms; msms)具有相同的可育表现型，只能通过测交才能鉴定其基因型，不仅增加了工作量，而且延缓了转育进程。利用分子标记辅助选择技术(MAS)是解决这一问题的有效途径。目前，MAS已经应用于水稻(文绍山和高必军, 2012; Iftekharuddaula et al., 2012)、玉米(李少博等, 2012)、大豆(李文滨和赵雪, 2010)等农作物雄性不育系转育实践。张英等(2006)用萝卜细胞质雄性不育的恢复材料作为供体亲本，用甘蓝型油菜作为回交亲本，利用常规转育方法结合AFLP分子标记辅助选择，从BC₁F₁中筛选出具有较高白菜型油菜遗传背景的可育单株。黄镇(2008)利用AFLP分子标记辅助选择培育出新型甘蓝型油菜的隐性核不育系。王丽丽等(2010)首次将SCAR标记syau_scr01应用到大白菜复等位基因雄性不育系转育中，但该标记只能辅助筛选含Ms基因的植株，对Ms^f和ms基因没有选择作用，而且所用SCAR标记与连锁基因遗传距离也较远。

本项研究利用前人在大白菜Ms基因精细定位中开发的26对SSR引物，分析这些引物在白菜薹亲本间的多态性，检验在分子标记辅助选择上应用的可行性。同时，设计连续回交定向转育方案，将分子生物学技术与传统转育方法相结合，创制白菜薹核基因雄性不育系。

1结果与分析
1.1白菜薹亲本基因型的确定
以大白菜“王子”甲型两用系不育株(MsMs)为母本，与白菜薹待转育亲本杂交，F₁代50株植株表现型全部为可育，证明待转育亲本的基因型为MsfMsf。遗传模式如图2。

图2 待转育亲本基因型鉴定模式 Figure 2 Genotype identification of the target line

1.2 SSR引物筛选
以白菜薹待转育亲本(Ms^fMs^f)、大白菜“王子”两用系不育株(MsMs)和保持系(msms) 3株纯和基因型植株的DNA为模板，用26对SSR引物分析3种基因型的多态性。在250~500 bp之间，GSSR1标记在白菜薹亲本(Ms^fMs^f)、不育株(MsMs)和保持系(msms)上均扩增出单一条带，且Ms^f与Ms、ms基因扩增片段长度不同，说明与Ms基因连锁的标记同样可以用来标记Ms^f和ms基因(图3)。

图3 GSSR1在MsfMsf, MsMs和msms间的多态性 注: M: D2000 maker; Msf: 育性恢复基因; Ms: 雄性不育基因; ms: 可育基因 Figure 3 Polymorphism among MsfMsf, MsMs and msms Note: M: D2000 maker; Msf: A fertile restoration gene; Ms: A male sterile gene; ms: A fertile gene

1.3定向转育遗传模式
根据白菜薹的基因型(Ms^fMs^f)，设计以大白菜雄性不育系(Msms)为不育源的定向转育方案(图4)。F₁代植株中有2种基因型，分别为Ms^fMs和Ms^fms，均表现为可育。选择7株自交获得F₂代，根据F₂代自交分离比率来确定F₁植株基因型(表1)。同时，利用分子标记GSSR1鉴定Ms或ms基因是否存在。PCR检测结果表明，F₁群体均能检测到两条清晰的条带(图5)，表明Ms与ms 基因已经转入白菜薹亲本中，但由于标记在这两个基因之间没有多态性，因此不能区分两用系方向植株和保持系方向植株。

图4 白菜薹复等位基因型雄性不育系定向转育遗传模式 Figure 4 Genetic Model for the directional transfer of the multiple-allele male sterile line in Chinese cabbage

表1 F2代群体可育株与不育株分离比率 Table 1 Segregation ratio for fertility and sterility in the F2 generation

图5 PCR验证Ms和ms基因已转入白菜薹亲本 注: M: D2000 maker; 1~7: F1代植株; Msf: 育性恢复基因; Ms: 雄性不育基因; ms: 可育基因 Figure 5 Ms and ms gene have been transferred into Chinese cabbage through PCR test Note: M: D2000 maker; 1~7: Plants of F1; Msf: A fertile restoration gene; Ms: A male sterile gene; ms: A fertile gene

1.4利用分子标记鉴定各回交世代植株基因型
在F₁植株自交的同时分别与白菜薹回交建立BC₁群体。根据F₁植株基因型鉴定结果，选出BC₁代两用系方向群体和临时保持系方向的群体。在BC₁代群体中，两用系方向植株有2种基因型(Ms^fMs和Ms^fMs^f)，保持系方向植株基因型也有2种(Ms^fms和Ms^fMs^f)，表现型均为可育。两个方向各选取30株，用GSSR1标记鉴定基因型。根据鉴定结果，将基因型为Ms^fMs和Ms^fms的植株移栽，当植株的植物学性状表现完全后，每个方向选择1株与轮回亲本相似的植株继续回交，获得BC₂，同此获得BC₃，鉴定结果如图6和图7。

图6 GSSR1对BC1, BC2 和BC3代两用系方向群体中MsfMs基因型的选择 注: 1~30: 每个回交世代两用系方向群体的植株编号; A: MsfMsf基因型; B: MsfMs基因型; 卡平方适合性测验表明分离比率符合孟德尔遗传定律 Figure 6 Selection results for MsfMs in AB line direction of BC1, BC2 and BC3 using GSSR1 Note: 1~30: Plants for each generation of AB line direction; A: MsfMsf; B: MsfMs; Card square fit test show that separation ratio according to mendelian inheritance law

图7 GSSR1对BC1, BC2和BC3代保持系方向群体中Msfms基因型的选择 注: 1~30: 每个回交世代保持系方向群体的植株编号; A: MsfMsf基因型; C: Msfms基因型; 卡平方适合性测验表明比率分离符合孟德尔遗传定律 Figure 7 Selection results for Msfms in AB line direction of BC1, BC2 and BC3 using GSSR1 Note: 1~30: Plants for each generation of temporary maintainer line direction; A: MsfMsf; C: Msfms; Card square fit test show that separation ratio according to mendelian inheritance law

经3次回交后，后代植株的植物学性状与回交亲本已基本相似。分别选取BC₃代Ms^fMs和Ms^fms基因型的植株自交，用以配制不育系。Ms^fMs(两用系方向)植株的自交群体中，存在3种基因型，包括Ms^fMs^f，Ms^fMs和MsMs。Ms^fms (临时保持系方向)植株的自交群体中也存在3种基因型，即Ms^fMsf、Ms^fms和msms。GSSR1分子标记辅助选择鉴定结果如图8所示。

图8 GSSR1对MsfMs和Msfms自交后代中目标基因型的选择 注: 1~30: MsfMs和Msfms自交后代群体的植株编号; A: MsfMsf基因型; D: MsMs或msms基因型; E: MsfMs或Msfms基因型; 卡平方适合性测验表明分离比率符合孟德尔遗传定律 Figure 8 Selection results for selfing generations of MsfMs and Msfms using GSSR1 Note: 1~30: Plants of selfing generations of MsfMs or Msfms; A: MsfMsf; D: MsMs or msms; E: MsfMs or Msfms; Card square fit test show that separation ratio according to mendelian inheritance law

在两用系方向的自交后代中，选择基因型为MsMs的植株与Ms^fMs基因型植株兄妹交，其后代即为“两用系”。“临时保持系”方向的自交后代中，选择msms基因型植株自交，即获得了“临时保持系”。同时，以两用系方向中的MsMs植株为母本，与保持系方向msms基因型植株杂交，其后代即为白菜薹复等位基因雄性不育系(Msms)，命名为BGMS-3 (图9)。

图9 用GSSR1 验证BGMS-3基因型 注: 1~30: 白菜薹核不育系BGMS-3植株群体; F: Msms基因型; MsfMs为对照 Figure 9 Genotype identification results of BGMS-3 using GSSR1 Note: 1~30: Plants of BGMS-3 population; F: Msms; MsfMs is control

1.5白菜薹核不育系的植物学性状鉴定
对创制的白菜薹核不育系BGMS-3、白菜薹转育亲本以及对照品种‘精选嫩薹一号’(CK)的植物学性状进行鉴定，结果列于表2。不育系BGMS-3与转育亲本在株高、株幅、薹叶数、最大薹叶长等植物学性状相近(图10)。BGMS-3与对照品种‘精选嫩薹一号’相比，其生长势较旺。

表2 白菜薹核不育系植物学性状调查结果 Table 2 Major botanical characters of the male sterile line in Chinese cabbage

图10 白菜薹核不育系BGMS-3及转育亲本的植株 注: A: 白菜薹待转育亲本; B: 白菜薹核不育系(BGMS-3); C: BGMS-3的不育花序 Figure 10 The plants of the male sterile line of BGMS-3 and the target line Note: A: The target line of Chinese cabbage; B: The multiple-allele male sterile line of Chinese cabbage (BGMS-3); C: Male sterile flowers of BGMS-3

1.6白菜薹杂交组合小区产量分析结果
以“BGMS-3”为母本，与6个白菜薹自交系(T1-T6)配制杂交组合，杂交组合编号为C1-C6，以‘精选嫩薹一号’为对照(CK)进行品种比较试验。随机区组设计，3次重复，小区面积为4.0 m×1.2 m，株行距为30 cm×60 cm。播种60 d后采收主薹，计算小区产量，结果列于表3。6个杂交组合的产量均高于对照，达到显著差异水平。其中C3、C6、C5和C1的小区产量极显著高于对照。筛选出一个强优势组合C3。

2讨论
白菜薹是近十几年来由湖南省逐渐发展起来的一种新兴蔬菜，具有较高的营养价值且杂种优势显著。用雄性不育系生产杂交种是利用白菜薹杂种优势的有效手段，但是，目前还没有发现关于白菜薹雄性不育系的研究。本项研究利用复等位基因遗传的大白菜雄性不育材料为不育源，设计了定向转育方案，采用连续回交的方法转育不育性和植物学性状，同时利用MAS筛选目标基因型植株，创制出了100%雄性不育、且植物学性状与待转育亲本相似的白菜薹核不育系，实现了不育性与植物学性状的同时转育。

表3 白菜薹杂交组合小区产量分析结果(单位: kg) Table 3 Plot yields of hybrid combinations in Chinese cabbage (nuit: kg)

雄性不育性的表现受植株发育阶段的限制，传统的育种方法通常等到植株抽薹开花后才能鉴定植株基因型。本试验采用分子标记辅助选择技术，借助与目标基因紧密连锁的分子标记，可以在苗期直接判断目标基因是否存在。在实际应用分子标记辅助选择育种时，被选择的群体一般都不是目标性状原始的定位群体，而且在不同群体中目标性状与标记间的重组率有一定的差异，因此用于辅助选择的分子标记与目标性状的重组率越低，选择的准确率越高(金素娟等, 2007)。本研究选用的分子标记GS- SR1，经验证是与大白菜核不育基因Ms共分离的SSR标记，在1056株不育株中均没有出现重组单株(刘志勇, 2010, 私人通讯)。GSSR1对白菜薹育种群体的选择准确率达到了100%。

以往采用测交鉴定基因型的方法来筛选植株，为了尽量减少工作量，样本数量较小(7株)，因此能够获得的携带目标基因型的植株通常只有几株。采用分子标记辅助选择基因型可扩大样本数量(30株)，获得的目标基因型植株达到十几株，再从中筛选与轮回亲本植物学性状相似的植株回交，加快了植物学性状的筛选速度，因此回交3代后，即可获得与白菜薹轮回亲本相似的核不育系。

以GMS-4为母本配置的6个杂交组合表现出显著的杂种优势。杂交组合间产量达到了极显著差异水平，经过综合考察, 筛选出C3组合为最优组合，其产量最高且植株整齐性最好，中熟，生长期为60 d。

3材料和方法
3.1植物材料
本研究所用材料均来自辽宁省十字花科蔬菜重点实验室。不育源材料为大白菜“王子”复等位基因型雄性不育系(供体)。待转育亲本为白菜薹高代自交系(受体)。用于配制杂交组合的父本为6个稳定遗传的白菜薹高代自交系T1、T2、T3、T4、T5和T6。

3.2 SSR分子标记
实验所用的26对SSR候选引物(GSSR1-GSS-R26)均为大白菜不育基因Ms精细定位时开发出的引物(表4)。经验证实验，GSSR1与不育基因Ms共分离。引物由北京天根公司合成。用2.0%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物多态性。

表4 用于MAS的SSR候选引物 Table 4 SSR primers for MAS

3.3 DNA提取及SSR反应体系的建立
 取幼嫩叶片，采用改良的CTAB法提取DNA (Williamson et al., 1994)。提取的DNA用1%琼脂糖凝胶电泳和凝胶成像仪检测质量。dNTP、Taq酶、Buffer均购自天根公司。PCR反应体系(10 μL)：1μL Buffer (10×)，0.8 μL dNTP (10 mmol/L each)，0.2 μL Taq酶(1 U)，1 μL模板DNA，1 μL引物(上下游)，补充超纯水至10 μL。扩增程序为：94℃预变性3 min，94℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min，共35个循环，72℃延伸5 min，4℃保存。PCR扩增反应在BIO-RAD iCycler PCR仪上进行。利用6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测PCR产物。

作者贡献
王秋实是本研究的实验设计和实验研究的执行人，完成数据分析，论文初稿的写作；刘志勇和张曦参与实验设计，试验结果分析；冯辉是项目的构思者及负责人，指导实验设计，数据分析，论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢
本研究由国家自然科学基金(31071792; 31272157)资助。

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